肝糖原提取、鉴定与定量实验报告x
时间:2020-11-12 13:01:46 来源:勤学考试网 本文已影响 人
生物化学实验报告
姓 名: 学 号: 专业年级: 组 别:
生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称
肝糖原的提取、鉴定与定量
实验日期
实验地点
合作者
指导老师
评分
XX 教师签名 李某某 批改日期 2013-06-03
格式要求: 正文请统一用: 小四号,宋体, 1.5倍行距;数字、英文用 Times New Roman; 标题用: 四号,黑体,加粗 。需强调的地方请用 蓝颜色标出。
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一、实验目的
1、掌握组织样品的制备方法,了解其注意事项。
2、了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项, 掌握其操作方法。
3、正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。
4、熟练运用溶液混匀的各种方法。
5、正确掌握溶液转移的操作。
6、正确操作使用分光光度计。
二、实验原理
1、肝糖原的提取与鉴定
糖原储存于细胞内,采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎,低浓度的三氯醋酸能使蛋 白质变性,破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质,而糖原仍稳定地保存于上清液中,从而使 用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。
糖原不溶于乙醇而溶于热水, 故先用 95%乙醇将 滤液中糖原沉淀,再溶于热水中。
糖原水溶液呈乳样光泽,遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中, 依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖,利用呈色反应 和葡萄糖的还原性,可判定肝组织中糖原的存在。
CuSO4十 2NaOH = Na2SO4+Cu(OH)2↓
2Cu(OH)2十C6H12O6 = 2CuOH十氧化型葡萄糖 +H2O
2CuOH = Cu2O↓(红色 )+H2O
Cu(OH)2= CuO↓(黑色)+H 2O
2、肝糖原定量测定
糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖, 浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物— —5- 羟甲基呋喃甲醛, 此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。
该物质在 620nm 处有最大吸收。糖含量在 (10~100)g 范围内,溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。
利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色, 通过标准对照法(直接比较法) 即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定,故在显色之前,肝组织先 臵于浓碱中加热,以破坏其它成分,而保留肝糖原。
三、材料与方法: 以流程图示意
1、材料:
(1)样品:鸡肝
(2)试剂: 95%乙醇、 5%( W/V )三氯乙酸、浓盐酸、 12.5mol/L(50%)NaOH溶液、 碘试剂、班氏试剂、 5.35mol/L( 30%)KOH 溶液、标准葡萄糖液( 50mg/L)、蒽酮显 色剂
( 3)仪器和器材:普通离心机、室温 -100℃恒温水浴箱、可见光分光光度计、托盘天 平、剪刀、镊子、研钵、试管架、离心管、试管、100mm*15mm 试管、刻度吸量管 (2ml、 5ml)、 1000μl 微量可调取液器、 100ml 容量瓶、白瓷反应板
2、方法:
1)肝糖原的提取与鉴定
鸡肝约 1g,剪碎
+5%CCl 3COOH 1ml
研磨至乳状
+5%CCl3COOH 3ml
研磨成肝匀浆
全部转入离心管中, 离心 3min( 4000r/min )
沉淀(弃去)上清液(取
沉淀(弃去)
上清液(取 2ml)
+2ml 95%
+2ml 95% 乙醇,混匀,静置 10min
离心 5min( 4000r/min )
上清液(弃去)沉淀
上清液(弃去)
沉淀
沸水浴 2min ,溶解沉淀
沸水浴 2min ,溶解沉淀
白瓷板孔穴中
糖原溶液 1ml
加碘试剂 2 滴 糖原溶液 2
加碘试剂 2 滴 糖原溶液 2 滴
加碘试剂 2 滴
+ 浓 HCL5 滴
沸水浴 15min ,冷却
呈色对比+50%NaOH 5
呈色对比
+50%NaOH 5 滴
糖原水解液 2
糖原水解液 2 滴
糖原水解液
+班氏试剂 4 滴
混匀
沸水浴 2min ,观察变化
2)肝糖原定量测定
四、结果与讨论: ①结果:实验数据、现象、图谱;②讨论:以结果为基础的逻辑 推论,并得出结论。
1、结果:
(1)实验现象:
1)肝糖原的提取与鉴定
第一次离心后,肝匀浆分为 2 层,上层为上清液,不完全澄清,下层为淡褐色沉淀
图1
图1 肝匀浆 图2 肝匀浆第一次离心后
加入乙醇混匀并静置后,溶液分层,上层为上清液,下层有白色絮状沉淀。
第二次离心后,溶液分为 2 层,上层为上清液,试管底部有少量白色沉淀
加入蒸馏水并沸水浴后,白色沉淀溶解
白瓷板上,糖原溶液加碘试剂后呈红棕色,与碘自身的黄色有明显区别
碘试剂 2 滴
图4 呈色对比结果(左为糖原溶液加碘试剂,右为碘试剂)
往糖原水解液中加入班氏试剂后,溶液呈蓝色(班氏试剂本身为蓝色)。沸水浴后,
溶液变为砖红色(生成砖红色沉淀)。
图5 糖原水解液图 6 沸水浴前砖红色沉淀
图5 糖原水解液
图 6 沸水浴前
砖红色沉淀
图 7 沸水浴后
2)肝糖原定量测定
往鸡肝中加入 KOH 并沸水浴后,溶液变为红棕色。
图
图
水浴前,空白管呈黄色,标准管呈绿色,样品管呈黄色(颜色比空白管浅)。水浴后,
空白管无明显变化, 标准管颜色略变深, 样品管由黄色变为深绿色 (颜色比标准管深)
图 9 水浴前 图 10 水浴后
2)实验数据:
测定次数 标准管 样品管
TOC \o "1-5" \h \z 0.593 0.401
0.593 0.397
0.594 0.396
平均值 0.593 0.398
表1 标准管和样品管测得的吸光度( A620)及平均值 按下式计算样品中肝糖原的含量:
A 样品 100 100 肝糖原( g/100g肝组织) = * 0.05 * * * 1.11
A 标准 肝组织重( g) 1000
由于样品稀释了一倍,因此计算结果需乘二。
结果:肝糖原的含量为 4.966g/100g 肝组织。
故本次实验结论为:该鸡肝样品含有肝组织,且肝糖原含量为 4.966g/100g 肝组织。
2、讨论:
( 1)实验数据分析:本次实验测得肝糖原含量为 4.966g/100g肝组织。查书得饱食鸡肝 肝糖原含量为 2~3g/100g 肝组织。本次实验结果偏大,说明肝组织中含有过多肝糖原, 试验所用鸡肝为脂肪肝。
2)呈色对比结果分析:糖原溶液与碘试剂反应呈红棕色,与碘试剂本身的黄色区别
明显,说明糖原含量较大。
(3)糖原水解液与班氏试剂反应结果分析:该反应主要是通过检测葡萄糖与班氏试剂 的还原性糖反应间接鉴定溶液中糖原的存在。糖原溶液被浓盐酸水解为葡萄糖,葡萄糖 中的醛基可被 Cu(OH)2 氧化为羧基,即把葡萄糖氧化为葡萄糖酸, Cu2+则被还原生成 Cu2O 砖红色沉淀。因此水浴后,溶液由蓝色变为砖红色,实验现象明显。
(4)注意事项: 1)蒽酮试剂为浓硫酸所配制,使用时应小心谨慎。若不慎沾到皮肤上,应立即用大量 清水冲洗。
2)离心后,用移液枪吸取上清液时应避免枪头触及沉淀,否则会使沉淀物上浮,导致 上清液浑浊。避免将枪头伸到液面下再按按钮,否则枪头喷出的气泡也会激起沉淀物。
3)打开室温 -100℃恒温水浴箱盖子时要小心水蒸气,以免烫伤。
4)使用离心机时要注意配平,否则会损坏离心机。
5)使用分光光度计时不得在仪器界面上转移试剂,以免腐蚀分光光度计。
6)肝糖原提取中,往上清液加入 95%乙醇时要充分混匀。溶液总量较大,混匀操作不 易,可用倾倒混匀或用玻璃棒搅拌混匀。
7)肝组织必须在沸水浴中全部溶解,否则影响比色。
8)蒽酮试剂必须 2 倍于被测液