黄酮标准曲线绘制实验报告x

黄酮 标准曲线绘制的实验报告

总黄酮的测定

实验仪器 电子天平 AR2140; 紫外可见分光光度计 UV2754; 型数控超声波清洗器 KQ3200DB; 超级恒温槽 ;

Rotavapor R200 旋转蒸发仪 ;

FD21C250冷冻干燥机2

试剂及药品

芦丁 标准品

硝酸铝 国产分析纯（配成 5 %）

亚硝酸钠 国产分析纯（配成 10 %）

氢氧化钠 国产分析纯配成（配成 1 mol/L ）

95%乙醇，无水乙醇 国产分析纯（配成 60%乙醇 50%乙醇）

DPPH（ 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl ，二苯代苦味肼基自由基）

Vc （Ascrobic acid ，维生素C,抗坏血酸） 没食子酸对照品：基准纯。

大青叶子 采摘于海南大学东坡湖畔

实验步骤：

准备工作及波长的确定

样品60C烘干粉碎机粉碎，过20目筛，装入试剂瓶中备用。根据查阅文献 总黄酮在波长为510nm处吸收值最大。

参照品芦丁标准溶液的制备

精密称取120 C干燥至恒重的芦丁标准样品 37.5mg置于100mL烧杯中，用 60%乙醇溶解后定容至25mL容量瓶中，摇匀，即可得1.5mg/mL的芦丁标准溶液。

标准品的测量及绘制标准曲线

精密吸取芦丁标准溶液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL ,分别置于

10mL 容量瓶中，并定容至刻度线。得到 0.0mg/ml、0.15mg/ml、0.3mg/ml、 0.45mg/ml、0.6mg/ml、0.75mg/ml、0.9mg/ml 的标准品溶液，分别取 1ml 至U试 管中各加5 %亚硝酸钠溶液0.3mL摇匀,放置6min ,加10%硝酸铝溶液0.3mL摇 匀,放置6min ,加1mol /L氢氧化钠溶液4mL ,再用60%S醇溶液稀释至刻度，放 置15min后,分别在510nm处测定其吸光度（Tai,Cai&Dai,2011 ）。（以试剂空白 做参比）

以吸光度A为纵坐标,浓度c为横坐标,绘制标准曲线。用最小二乘法进行 线性拟合,得c与A的线性回归方程以及相关系数 氏。

序号

浓度（ug/ml）

吸光度

1

0

0

2

15

0.180

3

30

0.349

4

45

0.546

5

60

0.727

6

75

0.884

7

90

1.063

表1-1 : 芦丁标准曲线测定数据

y = 0.0113x^0.0023

R"2 = 0.沁—

0 1 1 1 ' '

0 50 40 ED SO LOO

Rutin concentraiiontis/iil）

图1-2:芦丁标准曲线

135样品的测试

根据查阅文献总黄酮在波长为 510 nm处吸收值最大。取黄酮提取液， 取提

液2ml至10ml的比色管中用60%勺乙醇定容至刻度线则稀释 5倍。取稀释好的 溶液4份1ml置入10ml的比色管中，其中一份用60%勺乙醇定容，作为参比溶 液。其余各份各加5灿硝酸钠溶液0.3mL摇匀,放置6min ,加10%肖酸铝溶液 0.3mL摇匀,放置6min ,加1mol氢氧化钠溶液4mL,再用60%S醇溶液稀释至刻 度,放置15min后,分别在510nm处测定其吸光度。代入标准曲线回归方程可得浓 度数据(以芦丁为参比) , 三次结果取平均值。经换算后得样品中总黄酮含量

样品总黄酮含量 (mg/g)=X*n*V 1/( V *W)

式中：X—测出的浓度，mg/mL;(直接代入，不用换算。)

n—稀释倍数，量纲为1;

VI —样液总体积， mL;

V—测定时取样体积，mL;

W—样品质量，g。

总分含量的测定

实验仪器

ALZO4型电子分析天平：上海梅特勒一托利多仪器有限公司；

DELA犯0型pH计：上海梅特勒一托利多仪器有限公司； 723可见分光光度计 ：上海菩华科技仪器有限公司 ;

DK一 512型电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；

容量瓶(250mL, 10OmL 25mL)、比色管管(10mL);

烧杯、移液管、吸耳球。

试剂及药品

没食子酸对照品：基准纯，购于上海分析试剂厂，置 50 r真空干燥箱真

空中干燥 4 h 。乙醇为工业级，蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

Folin — Ciocalteu 比色法测定总酚酸含量

Folin —Ciocalteu 试剂的配制

称取20 g钨酸钠和5 g钼酸钠于圆底烧瓶中，用140 ml蒸馏水溶解，加入10ml 85%的磷酸溶液和20 ml浓盐酸，文火回流10 h，然后加入3 g硫酸锂及15 ml双 氧水，加热沸腾15 min至亮黄色，不得带微蓝和绿色。冷却，移入 250 ml容量瓶 中，定容，贮于棕色瓶中，4 r冰箱保存。

对照品溶液制备

准确称取15. 00 mg干燥的没食子酸，加蒸馏水适量，超声溶解，放冷，以 蒸馏水定容至50ml，制成0.3mg/mL没食子酸的溶液，作为对照品溶液。

将0.3mg/mL的没食子酸标准溶液分别配制成 0.0mg/mL，0.03mg/mL， 0.06mg/mL, 0.09mg/mL, 0.12mg/mL，0.15mg/mL、0.18mg/mL、0.21mg/mL的溶液， 分别取1m置于10m的容量瓶中，加入2 ml福林试剂，充分摇匀，加入0.75ml 7.5 %

碳酸钠溶液?混匀，以蒸馏水稀释至刻度。振荡一下，静置 2h(Guo&Wei,2011)。

同时制作空白管。为消除供试品溶液本身颜色的干扰，同时制作不加显色剂的对 照管。于765 nm波长处测定吸光度值。

2.3.3标准曲线的制备

以吸光度A为纵坐标,浓度c为横坐标,绘制标准曲线。用最小二乘法进行 线性拟合,得c与A的线性回归方程以及相关系数 氏。

序号

浓度

(ug/ml)

吸光度(WL765.0

0

0

0

1

3

0.132

2

6

0.284

3

9

0.411

4

12

0.582

5

15

0.712

6

18

0.843

7

21

1.013

表3-1 :没食子酸标准曲线测定数据

图3-1 :没食子酸标准曲线

2.3.4样品的测定

取提液2ml至10ml的比色管中用60%勺乙醇定容至刻度线则稀释 5倍。取 稀释后溶液1ml四份,分别置于10mL比色管中，加入2 ml福林试剂，充分摇匀， 加入0. 75ml 7.5 %碳酸钠溶液.混匀，以蒸馏水稀释至刻度。振荡一下，静置 2h。同时制作空白管。为消除供试品溶液本身颜色的干扰， 同时制作不加显色剂 的对照管。于765 nm波长处测定吸光度值。

总酚酸含量计算：

多酚含量(mg/100g)X(mg)

多酚含量(mg/100g)

X(mg)稀释倍数

0.5总酚酸称样量(g)

100

清除DPPH?的能力的测定

3.1.实验仪器、药品及试剂

实验仪器

ALZO4型电子分析天平：上海梅特勒一托利多仪器有限公司；

DELA犯O型pH计：上海梅特勒一托利多仪器有限公司；

723可见分光光度计：上海菩华科技仪器有限公司；

DK — 512型电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；

容量瓶(250mL, 10OmL 25mL)、比色管(10mL);

烧杯、移液管、吸耳球。

试剂及药品

DPPH( 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl ，二苯代苦味肼基自由基)；

Vc (Ascrobic acid ，维生素C,抗坏血酸)为分析纯；

无水乙醇，蒸馏水

配希9 DPPHW

配制0.06mMDPP试剂，放入冰箱4 C进行冷藏，以备用。

3.2.2参照品Vc标准溶液的制备

准确称取17.6mgVc到100mL的烧杯中用无水乙醇溶解后， 置于50mL的容量 瓶中定容至刻度线及可以得到 2mmol/L的母液，分别量1、2、3、4、5、6ml至 10ml的比色管中用无水乙醇定容至刻度线， 则可以得到0.2mmol/L、0.4mmol/L、

0.6mmol/L、0.8mmol/L、1mmol/L、1.2mmol/L的溶液。从以上比色管中分别取 0.1ml溶液置于试管中再加入3.9ml的DPPH反应30min,在517nm测出吸光值 (Thoo&Ho,2010)，用无水乙醇代替待测液作为对照， 用无水乙醇作空白，重复三 组。

清除率=[(Ac-Ai)/Ac] X 100%

式中，Ac： 0.1 mL无水乙醇加3.9mL DPPH溶液的吸光度；

Ai: 0.1 mL待测液加3.9mLDPPH溶液的吸光度。

323标准曲线的绘制

322测试数据及标准曲线的绘制

0

0

0

1

0.2

0.529

14.92

2

0.4

0.424

30.90

3

0.6

0.32

46.73

4

0.8

0.209

63.62

5

1

0.11

78.69

6

1.2

0.02

92.39

表 3-1 :

VC标准曲线测定数据

口 号

C (mmol/L)

吸光度 清除率/%

以吸光度A为纵坐标,浓度c为横坐标,绘制标准曲线。用最小二乘法进行

线性拟合,得c与A的线性回归方程以及相关系数 氏

图3-1 : VC含量与吸光度的关系

图3-1 : VC含量与清除率的关系

3.2.4 样品的测定

取提液 4ml 至 10ml 的比色管中用 60%的乙醇定容至刻度线则稀释 2.5 倍。

　取稀释后溶液O.ImL三份,分别置于10mL试管中，再分别加入配置好的DPPH溶 液3.9mL,摇匀，反应30min后，分别在517nm处测定其吸光度。代入标准曲线 回归方程可得浓度数据(以Vc为参比)，三次结果取平均值。经换算后得样品自 由基清除率。

清除ABTS自由基能力的测定

4.1ABTW自由基的配制

准确称取0.19215gABTS于50mL的容量瓶中，用无水乙醇定容，摇匀，浓度 7mmol/L；7mmol/LABTS +.与 2.45mmol/L 的高硫酸钾等体积混合， 在室温、避光 黑暗的条件下静置过夜反应 12~16h,形成ABTS+自由基储备液。该储备液在

室温，避光的条件下稳定。用前用无水乙醇稀释成工作液，于波长 734nm 处测 得其吸光度为0.7000 (± 0.02)，再装入棕色试剂瓶中，放入冰箱 4C进行冷藏， 以备用。

标准曲线的绘制

4.2.1参照品Vc标准溶液的制备及测试

准确称取8.8.mgVc到100mL的烧杯中用无水乙醇溶解后，置于50mL的容量 瓶中用无水乙醇定容至刻度线及可以得到 1mmol/L的母液，分别量1、2、3、4、

5、 6、7、8ml至10ml的比色管中用无水乙醇定容至刻度线，则可以得到0.1mmol/L、 0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L 的溶液。从以上比色管中分别取 0.1ml 溶液置于试管中再加入 3.9ml 的 DPPH， 反应 30min, 在 517nm 测出吸光值， 用 无水 乙醇 代替待测液作为 对照 (Zhu&Lian,2011) ，用无水乙醇作空白，重复三组。

清除率=[(Ac-Ai)/Ac] X 100%

式中， Ac：0.1 mL 无水乙醇加 3.9mL ABTS+ 自由基溶液的吸光度；

Ai：0.1 mL 待测液加 3.9mLABTS+ 自由基溶液的吸光度。

422测试数据及标准曲线的绘制

■ o 76543 2 100-60.0.0.O.

■ o 76543 2 10

0-60.0.0.O.O.

y=-0,75731+0. 6189

R“2 = 0. 9992

0. 2

0. 4

0. 6

VC Concentration iboI/1

VC Concentration iboI/1

图4-1Vc浓度与其吸光值的关系

y = IIS. 77x-O.OaSTo)00 0 0 0 00 8 6 4 2

y = IIS. 77x-O.OaST

o

)00 0 0 0 0

0 8 6 4 2 警FTPf ML月吕 芯 uTJH&ntAUQ 舄

0.2

0.4 O.S

VC CojlCeiitTati.Oll A*ol/1

o.s

丿序号

C( mmol/l)

吸光度

清除率/%

1

0

0.00

2

0.1

0.57

12.04

3

0.2

0.493

23.92

4

0.3

0.422

34.88

5

0.4

0.351

45.83

6

0.5

0.276

57.41

7

0.6

0.2

69.14

8

0.7

0.118

81.79

9

0.8

0.035

94.60

表4-1 : Vc浓度与吸光值和清除率的数据

图4-2 : Vc浓度与其清除ABTS能力的关系

还原能力的测定

实验试剂 磷酸盐缓冲溶液(配成 PH6.6 0.2mol/l ) ; K 3Fe(CN) 6 溶液(配成 1%);

三氯乙酸(配成 10%)；

FeCb (配成 0.1%);

没食子酸 无水乙醇

标准曲线的绘制

试剂的配制

磷酸盐缓冲溶液 (pH6.6 0.2mol/L) ：准确称取 7.16g 的磷酸氢二钠至 100mL 的烧杯中用蒸馏水溶解后，置于 100mL 的容量瓶中用蒸馏水定容，即可得到 0.2mol/L 的磷酸氢二钠，同样的方法配制 0.2mol/L 的磷酸二氢钠。准确量取 37.5mL的0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和62.5mL的0.2mol/L磷酸二氢钠溶液至烧 杯中，用pH校正既可以得到磷酸盐缓冲溶液(pH6.6 0.2mol/L)。

标准溶液的配制及测试

用没食子酸做标准曲线其浓度范围在 50—300ug/ml，准确称取50mg没食子 酸到100mL烧杯中用无水乙醇溶解后，置于容量瓶中用无水乙醇定容至刻度线， 得到 0.5mg/ml 的母液，在分别取 1mL 2mL 3mL 4mL 5mL 6mL至 10mL的容 量瓶中用无水乙醇定容至刻度先， 得到 50ug/ml 100ug/ml 150ug/ml 200ug/ml 250ug/ml 300ug/ml 的溶液，取不同浓度的待测液或样品 1ml 于试管中，依次 加入PH6.6磷酸盐缓冲溶液(0.2mol/l )2.5ml和1% K3Fe(CN)6溶液2.5ml后 混合均匀，混合液于 50 C水浴 20min,再加入10%的三氯乙酸 2.5ml。于

(3000r/min )离心 10min, 取 2.5ml 的上清液再依次加 2.5ml 蒸馏水和 0.1%的 FeCl3 0.5ml混合均匀，静置10min在700nm处测定吸光值，通过在700nm下的 吸收值来测量提取物的还原能力，吸光值越高表明还原力越强， EC。的计算是吸

光值为 0.5 时的浓度 (Roy&Laskar,2011)。

523测试数据及标准曲线的绘制

gallic acid

Test set

concen trati on ug/ml

Absorbe ncy

1

0

0

2

50

0.59

3

100

1.1

4

150

1.527

5

200

2.073

6

250

2.579

7

300

3.1

表5-1 :没食子酸的质量浓度和吸光值的数据

Gal 丄 ic 心 tmc 亡 ntrHti onug/mL

图5-1 :没食子酸的质量浓度与其吸光值的关系

超氧自由自测定

实验试剂

1 实验试剂

Tris-Hcl 缓冲液(配制 PH8.20 50mmol/L)

邻苯三酚 ( 配制 3mmol/L)

VC

无水乙醇

标准曲线的绘制

6.2..1 试剂的配制

Tris-HCl (pH8.2 50mmol/L )缓冲溶液：取 0.6057g 三羟甲基氨基甲烷

(Tris ),蒸馏水溶解定容至50mL容量瓶；取0.309mL分析纯盐酸溶液至100mL 的容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，即得 0.1mol/L 盐酸溶液；分别取配置好的 Tris50mL和0.1mol/L盐酸溶液22.9mL于100mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度， 用pH计进行校正即可以得到Tris-HCl (pH8.2 50mmol/L)缓冲溶液。邻苯三酚： 配制10mmol/L的稀盐酸，取0.310mL分析纯盐酸溶液至1000mL的容量瓶中用蒸 馏水定容至刻度线；取焦性没食子酸 0.0095g，至25mL的容量瓶中用10mmol/L 的稀盐酸溶液定容至刻度线。

6.2.2标准溶液的配置及测试

精密称取 V标准样品0.0300g置于100mL烧杯中，用纯净水溶解后定容至 100mL容量瓶中，即可得0.3mg/mL的Vc标准溶液。

将 0.3mg/mL 的 Vc标准溶液分别配制成 0.0mg/mL，0.03mg/mL，0.06mg/mL， 0.09mg/mL， 0.12mg/mL， 0.15mg/mL， 0.18 mg/mL,0.21 mg/mL,0.24 mg/mL,0.27 mg/mL,0.3 mg/mL的溶液，分别加入 4.5mL 的 Tris-HCl ( pH8.2 50mmol/L)缓冲 溶液于10mL的试管中，再加入1mL不同浓度样品或待测液，25C反应10mi n, 再加入25C预热的邻苯三酚0.1mL (3mmol/L用10mmol/L的盐酸配制)，迅速摇 匀，于325nm出测定，加入邻苯三酚即开始计时，每隔 30s读取一次，至5min,

做好记录。邻苯三酚的自氧化速率以无水乙醇代替样品， Tris-HCl 缓冲溶液作 空白。

清除率 ％=[(△ Ac- △ Ai)/ △ Ac] x 100%

式中，△ Ac：邻苯三酚自氧化速率；

△ Ai :加入待测液后邻苯三酚自氧化速率

cc-HouM-lJWbouJH

cc-HouM-lJWbouJH

1

/m

g

623测试数据及标准曲线的绘制

吸光值

自氧化速 率

抑制 率

序号

时间min

1st

5th

丿序号

邻苯三酚0.1ml

0.142

0.411

0.06725

1

浓度ug/ml 0

0

0

0

0

2

30

0.032

0.246

0.05350

20.45

3

60

0.015

0.179

0.04100

39.03

4

90

0.012

0.13

0.02950

56.13

5

120

0.007

0.074

0.01675

75.09

6

150

0.006

0.025

0.00475

92.94

表6-1： Vc的质量浓度与吸光值和抑制率的的数据

图6-1： Vc的质量浓度与其清除超氧自由基关系