植物愈伤组织诱导培养实验指导--李老师x
时间：2020-10-21 12:31:41 来源：勤学考试网 本文已影响 人 
植物组织培养基的配制与植物愈伤组织诱导
一、 实验目的；
通过植物组织培养基和植物愈伤组织诱导实验的学习和训练，使学生了
解植物组织培养的基本原理和操作技术，初步掌握 MS固体培养基制备
方法、外植体的常规灭菌技术以及愈伤组织诱导方法。
二、实验原理：
根据植物细胞全能性原理，培养植物材料。即在无菌条件下，将植 物的器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）放在人工培养基上进行培 养，通过细胞分裂，形成一团薄壁细胞，即愈伤组织。愈伤组织可以在 适宜的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下进行再分化，重新 产生出植物的各种器官和组织，进而发育成完整的植株。
三、实验内容实验包括以下
三、实验内容
实验包括以下3部分内容:
实验1-1、植物组织培养基母液的配制和保存
实验1-2、MS培养基的配制与灭菌
实验1-3、胡萝卜愈伤组织的诱导
实验1-1植物组织培养基母液的配制和保存
1、目的要求 学习植物组织培养基母液的配制方法，为培养基的配制
做准备。
2、基本原理 植物培养基是植物离体培养的组织或细胞赖以生存的营养基质，是为离 体培养材料提供近似活体生存的营养环境，主要包括水、大量元素、微 量元素、铁盐、有机复合物、糖、凝固剂和植物生长调节等物质。
在配制培养基前，为了使用方便和用量准确， 常常将培养基成分首先配
制成比实际培养基浓度大若干倍的母液，然后在配制培养基时，再根据 所需浓度，按比例稀释。本实验以 MS培养基为例，学习培养基母液的
配制。
MS培养基母液可分为：MS大量元素母液、MS微量元素母液、MS铁盐 母液和MS有机化合物母液等。另外，还要配制生长激素母液，在不同 类型的培养基中使用。
3、实验仪器设备和试剂 3.1仪器、用具
分析天平、酸度计（或 pH试纸）、冰箱、药匙、玻棒、称量纸、滴管、 洗瓶、记号笔、烧杯（50ml、100ml、200ml）、容量瓶（100ml、500ml、
1000ml）、磨口试剂瓶（100mL、200mL、500ml、1000ml）、量杯、量 筒、移液抢、微波炉等。
3.2试剂
（1） 95%乙醇、1mol/L NaOH、1mol/L HCl。
（2） MS培养基成分：
大量元素（母液 I ） : NHNO、KNO CaCb2H2O MgSO7mO KHPO;
微量元素（母液口 ） : KI、HBQ MnSQ4H2O ZnSQ.7H2O NQM0Q.2H2O CuSQ5H2O C0CI2.6H2Q； ③铁盐（母液川）:FeSQ.7H2Q NQ.EDTA.2H2Q； ④有机成分（母液,维生素和氨基酸）：肌醇、盐酸吡哆醇（维生素&）、 烟酸（Vpp）、盐酸硫胺素（维生素Bi）、甘氨酸；
（3）植物生长调节物质：2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D） o
4、操作步骤
（1） MS大量元素母液的配制
按照培养基配方的用量，把各种化合物扩大 10倍，按照表1中的次序
分别准确称量后，分别用 50ml烧杯，加入蒸馏水 30 ml溶解（可以加 热至60C?70C,促其溶解）。溶解后，按顺序倒入一大烧杯中（烧杯 中事先加入约50ml的蒸馏水，目的避免由于盐浓度过高使钙离子与磷 酸根离子、硫酸根离子形成不溶于水的沉淀），注意最后加入氯化钙溶 液，混匀，用250mL容量瓶定容。将配制好的母液倒入试剂瓶中，贴好 标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于 4C冰箱中保存备
用。
表1 MS培养基大量元素母液（10倍）的配制剂量
母液
化合物名
称
培养基
用量
（mg/L
）
扩大
倍数
称取量
（mg）
母液体积
（mL）
1L培养
基吸取母
液量
（mL）
大量
KN0 3
1,900
10
4,750
250
100
NH4NO3
1,650
4,125
MgSO 4 7
H2O
370
9,25
丿兀素
KH2PO4
70
425
CaCI 2 2H
2O
440
1,100
微量兀素母液的配制
按照培养基配方的用量，将微量元素各种化合物(除去铁盐)扩大 100
倍(表2)，用万分之一天平分别准确称取，可以混合溶解，最后定容。
将配制好的母液倒入试剂瓶中，贴好标签，注明母液名称、配制日期、
配制人姓名，置于4 C冰箱中保存备用。
表2 MS培养基微量元素母液(100倍)的配制剂量
母液
化合物名称
培养基用量
(mg/L )
扩大倍
数
称取量
(mg)
母液体
积(mL)
1L培养基吸
取母液量
(mL)
微
MnSO 4 4H2O
22.3
223
量
ZnSO4 7H2O
8.6
100
86
100
10
元
H3BO3
6.2
62
素
KI
0.83
8.3
Na2MoO 4 2H2
O
0.25
2.5
CuSO 4 5H2O
0.025
10ml*
C0CI2 6H2O
0.025
10ml**
*、** :因天平均存在误差，为减少误差带来的影响，建议称取 0.25g ,
溶解并定容至10ml容量瓶中，然后移取 10ml，加入混合液中。
（3）铁盐母液的配制
常用的铁盐是FeSQ7H2O和Na2-EDTA的螯合物，必须单独配成母液。
配制时，按照扩大后的用量（表 3）,分别称取FeSq7H2Q和Na?-EDTA
分别溶解后，将FeSQ溶液缓缓倒入Na?-EDTA溶液（需加热溶解），搅拌 均匀使其充分螯合，定容后贮放于棕色玻璃瓶中，贴好标签，注明母液 名称、配制日期、配制人姓名，置于 4C冰箱中保存备用。
表3 MS培养基铁盐母液（100倍）的配制剂量
母液
化合物名称
培养基用
量（mg/L ）
扩大倍
数
称取量
（mg）
母液体
积（mL）
1L培养基吸
取母液量
（mL）
铁盐
Na2-EDTA
37.3
373
FeSO 4 7H2O
27.8
100
278
100
10
有机物母液的配制
按照表4中各成分浓度扩大后的用量，用感量 O.OOOIg天平分别称量各
有机物。可以分别溶解定容，分别装入试剂瓶中，也可以混合溶解定容， 装入同一试剂瓶中，写好标签，放入冰箱中保存。一般有机物都溶于水， 但叶酸(VBc)先用少量稀氨水或 1mol/L NaOH溶液溶解；VH (生物素) 先用1mol/L NaOH溶液溶解；VA、VD3、VB12应先用95%乙醇溶解，然 后再用蒸馏水定容。将配制好的母液倒入试剂瓶中，贴好标签，注明母 液名称、配制日期、配制人姓名，置于 4C冰箱中保存备用。
表4 MS培养基有机物母液(100倍)的配制剂量
母液
有机物名称
培养基用
量
(mg/L)
扩大倍
数
称取量
(mg)
母液体
积(mL)
1L培养基吸
取母液量
(mL)
甘氨酸
2.0
20
有
Vb1
0.4
4
机
Vb6
0.5
100
5
100
10
物
烟酸
0.5
5
肌醇
100
1,000
(5)激素母液的配制
激素母液必须分别配制，浓度根据培养基配方的需要量灵活确定，一般
是0.1?2mg/ml，根据需要确定配制的浓度。称量激素要用感量为万分
之一天平。本实验选用激素 2, 4-二氯苯氧乙酸(2, 4-D)。
2,4-D母液的配制方法为：准确称取10mg 2,4-D,称量后先用少量(1-3ml) 95%乙醇完全溶解后，加蒸馏水定容至100ml,即得到0.1mg/ml的2,4-D 贮备液，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、浓度、配制日 期、配制人姓名，置于 4C冰箱中保存备用。
(6)在配制母液时注意事项：
培养基各试剂应使用分析纯。
在称量时应防止药品间的污染，药匙、称量纸不能混用，每种试剂使 用一把药匙，多出的试剂原则上不能再倒回原试剂瓶。
母液配制好后，贴上标签，写清母液名称、试剂浓度或扩大倍数、配
制日期，并存放在4C冰箱中。使用前，要进行检查，若发现试剂中有 絮状沉淀、或长菌、或铁盐母液的颜色变为棕褐色，都不应再使用。
5、 结果记录与分析
记录本小组配制的培养基母液种类、 扩大倍数、母液配制体积、母 液中各成分的称取量。
仔细观察在配制母液过程中的现象与遇到的问题， 如是否产生浑浊 或沉淀，并分析出现混浊的原因。
6、 思考题
（1）配置大量元素母液、铁盐母液时，应注意些什么?
（2）配置激素母液时，应注意些什么?
实验1-2植物组织培养基MS的配制与灭菌
1、 目的要求
学习植物组织固体培养基的配制，学习高压灭菌器的使用，为外植体的
接种与初代培养做准备。
2、 基本原理
在植物组织培养中，固体培养基是最常用的一种培养基类型。由于培养
基中含有植物细胞生长所必需的各类营养物质， 主要包括水、大量元素、
微量元素、铁盐、有机复合物、糖、凝固剂和植物生长调节物质，因此， 培养基也是微生物繁殖的极好场所。 所以，必需对培养基进行灭菌处理，
以确保无菌操作的顺利进行。
本实验以可用于胡萝卜等植物初代培养的培养基 MS+1mg/L2-4D+3%蔗
糖+1%琼脂，pH5.8。配制1L为例，学习培养基的配制方法。
3、 实验仪器和试剂
（1）仪器、用具
高压灭菌锅，超净工作台、分析天平 （O.OOOIg）、pH计（或pH试纸）、微 波炉、手术剪刀、解剖刀、镊子、药匙、玻棒、称量纸、洗瓶、记号笔、
烧杯（1000ml ）、量杯、量筒（1000ml， 100ml，50ml）、耐热皮筋（或棉
绳）、100 ml三角瓶（每人按3-4瓶准备）、培养皿（每2人按1套准备）、 封口膜、定性滤纸等。
（2）试剂
①95%乙醇、1mol/L NaOH、1mol/L HCI。 ② MS培养基各母液、
2-4D母液、蔗糖、琼脂。
4、操作步骤
（1）器皿准备 清洗三角瓶、烧杯、量筒、量杯、镊子、手术刀、培
配制的培养基体积（mL ）母液的扩大倍数养皿、打孔器等，烘干或自然晾干备用。
配制的培养基体积（mL ）
母液的扩大倍数
（2）计算母液使用量 根据下面公式量取母液:
培养基配制量（L） *激素使用浓度（mg/L ）
激素母液用量（mL
激素母液用量（mL）=
激素母液浓度（mg/ml ）
配制1000ml培养基需要加入各母液的量分别为:
大量元素母液：100ml 微量元素母液：10ml 铁盐母液：
10ml
有机物母液：10ml 激素母液：10ml
（3）配制
称取适量的琼脂（常用量10g/L）置于1000ml大烧杯中，加蒸馏水500ml 左右，在微波炉中加热使之溶解，待琼脂完全溶化后，加入蔗糖（常用 量30g/L），溶后，加入上述各种母液，最后，加蒸馏水定容到需配培养 基的终体积。
每组配制 MS固体培养基1000ml，培养基组成为： MS+1mg/L 2,4-D+3%
蔗糖+1%琼脂（PH5.8）。
（4） pH值调节
充分混合，待温度降至50 C?60 C时，用1mol/L NaOH容液或1mol/L HCl 溶液调pH值到5.8，注意用玻璃棒不断搅动。
（5） 分装
搅匀培养基并迅速分装在 100mL的三角瓶中（温度低于40 C以下琼脂就
会凝固），每瓶25mL-30 mL左右，1000mL培养基可以分装至 30?40瓶，
迅速盖上封口膜，用封口材料包上瓶口，扎口后，写上标记，注明配制 者姓名和配制日期，准备灭菌。注意：分装时不要把培养基弄到管壁上， 以免日后污染。
（6） 灭菌
培养基内含有丰富的营养物质，有利于细菌和真菌繁殖，所以培养基配
好后要及时灭菌，同时将接种用具，如镊子、解剖刀、蒸馏水、培养皿 （装有滤纸）等进行灭菌。
使用高压锅灭菌要注意以下几点：
① 检查灭菌锅外层锅内水位， 水量过少时应加蒸馏水。 把分装好的培养
基放入灭菌锅的消毒桶内。盖上锅盖，上好螺栓后接通电源加热。
排放冷空气，关闭放气阀，当灭菌锅盖上的压力表指针移至 0.1Mpa（121 C ），控制压力表稳定在该压力下 15分钟，即达到灭菌目的。
灭菌后，先切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，待灭菌锅压力表指 针降到0时，打开排气阀，旋松螺栓，开启锅盖，取出已灭菌的培养基， 置于水平台子上，在室温下冷却，同时取出灭菌水、培养皿、镊子、解 剖刀、滤纸等。
灭菌后的培养基应在室温下放置 2—3天，观察有无微生物生长，以
确定培养基是否灭菌彻底。经检查没有杂菌生长时方可使用。
要求：每人准备培养基 3-4瓶。
5、 结果记录与分析
（1） 仔细记录培养基制备中，各种母液、试剂称量的量。
（2） 观察在配制培养基过程中的现象与遇到的问题，并加以解释。
6、 思考题
（1）培养基表达式：MS+1mg/L2-4D+2.5%蔗糖+1%琼脂，pH5.8，表达的 含义是什么？
实验1-3 胡萝卜愈伤组织的诱导
1、实验目的
（1）学习植物材料表面灭菌的常规方法;
（2） 了解接种的无菌操作技术;
（3）学习诱导植物器官形成愈伤组织的方法
2、 实验原理
植物组织培养是应用无菌操作的方法，培养离体的植物器官、组织或细
胞的过程。如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选
择合适的消毒剂对植物外植体进行消毒，获得无菌材料进行组织培养， 这是取得组织培养成功的前提和重要保证。
由于植物细胞具有全能性， 外植体在合适的培养基上， 可以通过脱分化，
形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团 一一愈伤组织。
3、 实验仪器和试剂
仪器：超净工作台、光照培养下、酒精灯、打火机、橡皮筋、记号笔、
脱脂棉1包、8把水果刀、8个1000ml烧杯（装废液用），8个500ml广口 瓶，内装75%酒精及棉球、8个150ml锥形瓶，内装 75%酒精100ml，8 个250ml试剂瓶，内装HgC2或次氯酸钠的消毒液。
无菌器材：吸水纸（定性滤纸）、25套直径90mm的培养皿、8个250ml 三角瓶（或烧杯），8瓶500ml无菌水、8把大号镊子、8把解剖刀。
植物材料：直根胡萝卜。
试剂：95%乙醇、0.1%氯化汞（或次氯酸钠）。
培养基：MS+1mg/L 2,4-D+30g/L 蔗糖 +10g/L 琼脂,pH5.8
4、实验步骤
（1）接种前，用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面， 将培养基及接种用 具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯及接种间紫外灯，照射
约30 min，然后关闭紫外灯，通风 20 min后，打开日光灯即可进行无菌 操作。
（2） 外植体预处理：将胡萝卜根用流动的自来水冲洗干净，用小刀削
去其表皮1-2mm，切成大约15-20mm厚的块段，置于 250ml三角瓶或 大烧杯中。
（3） 双手用肥皂洗净，以70%乙醇棉将手擦试一遍。
以下操作全部在无 菌条件下进行。
（4） 外植体消毒：将胡萝卜片放人已灭菌的 250ml三角瓶（或大烧杯）
中，先用70%酒精对胡萝卜消毒 5min，然后将酒精倒掉，再用 0.1%的 升汞消毒10min-12min （或用30%的次氯酸钠的消毒液将植物材料淹没 浸泡约30分钟），倒掉消毒液，然后用无菌水中漂洗 3次，每次2分钟，
洗时不断摇动三角瓶以确保完全除去消毒液。
（5） 将胡萝卜片放入垫有无菌滤纸的培养皿中，一手用消毒好的镊子 固定胡萝卜，一手用灭菌后的解剖刀切除胡萝卜块段截面的表面部分，
余下部分切成包含形成层的长、宽约 5mm，厚约1mm的小片。在完成
切割后，将解剖刀和镊子放入 95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧
灭菌之后，放回原处，待冷却后即可使用。注意：在每一次使用镊子、 解剖刀后，都要对其消毒一次。
接种：在酒精灯焰附近处，取下三角瓶的封口膜，用火烧灼瓶口
用无菌镊子夹取胡罗卜溥片并迅速半插入琼脂培养基上， 每瓶放4-5片，
注意将近根尖的一面接触培养基。将培养瓶口在酒精灯焰上小心地轻转 灼燎数秒，立即用封口膜封好瓶口。
培养：将接种后的三角瓶放到光照培养箱中，在 25 C下的黑暗中
培养3-4周。
5、 结果记录与分析
接种1周-10天后，调查、计算污染率：
污染率(％)=污染的材料数/接种材料数x 100%
每周观察并记录胡萝卜外植体产生愈伤组织的情况，包括出现愈
伤组织前培养物的形态，愈伤组织出现的时间以及愈伤组织的形态特征
(愈伤组织的颜色、质地等)，4周后调查、计算愈伤组织诱导率：
诱导率(%)=形成愈伤组织的材料数/接种材料数X 100%
6、 思考题
(1 )分析影响愈伤组织诱导的主要因素。
(2)以胡萝卜为材料为什么要强调要切取含有形成层部分，胡萝卜其
它部分(如茎、叶、花)能否诱导出愈伤组织？
