细胞原代培养实验报告
时间:2020-09-05 00:16:03 来源:勤学考试网 本文已影响 人
实验 十一 细胞的原代培养
一、实验目的
1、了解细胞体外培养的原理、基本方法。
2、掌握无菌操作方法及注意事项。
3、学习观察体外培养细胞的形态及生长状况。
二、实验原理
模仿体内生长环境,使来自机体的细胞、组织、器官能够在人工培养条件下生存、生长、繁殖。
三、实验器材
1、纯水设备:纯水仪
2、干燥消毒设备:电热干燥箱、高压蒸汽消毒锅、过滤器及0.22 ?m滤膜;
3、超净工作台
4、培养设备: 普通培养箱、CO2培养箱;
5、贮存设备:冰箱、液氮罐
6、观察设备:倒置显微镜
7、其他设备:天平、离心机、水浴锅等
培养主要用品
1、培养瓶、皿:以玻璃器皿为主 ,应选择透明度好、无毒、中性硬度玻璃制品
(1)培养瓶
(2)培养皿
2、血球计数板
3、眼科剪、镊;
实验材料
7-14日龄鸡胚
(肝素)抗凝血
原代培养材料选择
幼体组织(尤其是胚胎组织)比成年个体的组织容易培养
分化程度低的组织比分化高的容易培养
肿瘤组织比正常组织容易培养。
实验试剂
1、D'Hanks液
KH2PO4 0.06g,NaCl 8.0g,NaHCO3 0.35g,KCl 0.4g,葡萄糖1.0g,Na2HPO4?H2O 0.06g,加H2O至 1000ml
注:Hank's液可以高压灭菌。4℃下保存。
2、o.25%胰蛋白酶( D'Hanks液配)
3、M199 培养液
小牛血清 、4.
5、青、链霉素
6、5%NaHCO3、 2%碘酒
7、75%酒精
8、洗液:由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成
四、实验方法与步骤
一)培养前的准备工作
1、用品清洗与消毒
2、溶液配制与消毒
(1) 培养液、酶、抗生素等生物活性成分需过滤消毒
(2)平衡盐等高压蒸汽消毒
3、 预热溶液
4、 工作间及超净台消毒:紫外线、消毒液。
5、 洗手和着装
6、 进入无菌室
7、关闭超净工作台内的紫外光灯,点燃酒精灯(一切操作均需在酒精灯火焰下进行)将消毒过的所用物品放入超净工作台中
组织块培养法培养鸡心肌细胞步骤
1、配M199完全培养液:
M199基础培养液 90%
小牛血清 10%
青霉素 100IU/ml
链霉素 100?g/ml
过滤除菌。
2、获取心脏
① 消毒鸡胚蛋:泡入70%酒精
② 取出鸡胚,Hank's液洗涤。
③ 取出心脏,放入Hank's液中。
3、处理心脏
1、Hank's液漂洗心脏
2、剪成约1 mm3大小的小块。
3、 洗组织块。
Hank's液洗一次,培养液洗一次。
4、摆放:间隔2cm
5、贴壁。
6、加培养液培养
分离细胞培养法培养鸡表皮细胞步骤
(一)胰酶消化法
1、消毒、取材
2、洗涤:用DHank's液洗涤三次。
液洗三次。Hank's再用,)1mm2(在小青霉素瓶中用手术剪将组织块剪成小块、3.
4、视组织块量加入5—6倍的0.25%胰酶液,37℃中消化20—40分钟,每隔5分钟振荡一次,或用吸管吹打一次,使细胞分离。
5、加入3—5ml培养液以终止胰酶消化作用(或加入胰酶抑制剂)。
6、静置5分钟,使未分散的组织块下沉,取悬液加入到离心管中,1000rpm离心8分钟,弃上清液。
7、加入Hank's液2ml,冲散细胞,再离心一次,弃上清液。
8、加入培养液l—2 ml(视细胞量),血球计数板计数。
9、将细胞调整到5×105/ml左右,转移至25ml细胞培养瓶中,37℃下培养。
五、注意事项
1、操作前要洗手,进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。
2、点燃酒精灯,操作在火焰附近进行,耐热物品要经常在火焰上烧灼,金属器械烧灼时间不能太长,以免退火,并冷却后才能夹取组织,吸取过营养液的用具不能再烧灼,以免烧焦形成碳膜。
3、操作动作要准确敏捷,但又不能太快,以防空气流动,增加污染机会。
4、不能用手触已消毒器皿的工作部分,工作台面上用品要布局合理。
5、瓶子开口后要尽量保持45°斜位。
6、吸溶液的吸管等不能混用。
7、严格无菌操作。自取材开始,保持所有组织细胞处于无菌条件。(细胞计数可在有菌环境中进行。
)
8、凡在超净台外操作的步骤,各器皿需用盖子或橡皮塞,以防止细菌落入。
注意黏附。
结果观察
1、植块培养:培养2-3天,细胞从植块向外迁移,随着培养时间延长,在植块周围形成一圈细胞——“晕”,称之为生长晕(growth hallow)。
2、离散细胞培养:有单细胞贴壁或分裂成片