组织总RNA提取--用于miRNA分析(TRIZOL)
时间:2020-09-11 17:50:56 来源:勤学考试网 本文已影响 人
组织总RNA提取(TRIZOL)
器具和耗材
加样器一套、匀浆机、离心机
RNase-free的2ml管、RNase-free的各种规格吸头(1ml、200ul、10ul)
镊子、研苯、保温杯
试剂:
Trizol、氯仿、异丙醇、75%乙醇、RNase-free水
操作步骤:
A 准备工作
至少在实验前2小时将清洗干净的研钵加入适量酒精,点燃;
清理实验台面,清除易燃物品;
根据样品编号清晰标记RNase-free的1.5ml管;
每管加1.2mlTrizol试剂,盖好盖子;
将冻存样品从-70℃冰箱转移至装有液氮的保温杯中。
B 组织研磨和匀浆
1. 取冰冻组织材料50-100mg置于放有液氮的研钵中,在研钵中加液氮研磨成粉末(尽量细),注意持续补充液氮;(如果组织块很小,一般不用研钵研磨,直接加入Trizol,用匀浆器匀浆。)
2. 用在液氮中预冷的1ml吸头转移组织粉末至已装有1.2mlTrizol的离心管中,迅速摇开冰冻组织;
3. 立即用组织匀浆机匀浆,如果没有组织匀浆机可用Votex;
4. 匀浆后置于室温静置5分钟(或更长)。
C 氯仿抽提去除蛋白和DNA
加入300ul氯仿(每毫升Trizol加0.2ml氯仿),剧烈震荡混匀,室温静置10分钟或更长。
12000g,4℃离心15分钟
D 沉淀、溶解RNA
将上清液转移到新的2ml离心管中,加入等体积异丙醇(约800ul)(一般,每毫升Trizol加0.5ml异丙醇;但如果加与上清液等体积的异丙醇,会增加RNA尤其是miRNA的得率);上下颠倒混匀,置-20℃冰箱放置2小时以上(一般,此步是置室温搁置10分钟即可,但如果置-20℃冰箱放置过夜,会增加RNA尤其是miRNA的得率)。
12000g,4℃离心30分钟(一般,离心10分钟即可,但如果离心时间为20-30分钟,会增加RNA尤其是miRNA的得率。另外,我们在提取总RNA用于miRNA分析时,这一步使用25000×g离心15分钟)。
小心去掉上清液,沉淀用2ml 的75%乙醇洗涤(将沉淀飘浮起来即可),不需打碎。
12000g,4℃离心15分钟。(我们在提取总RNA用于miRNA分析时,这一步使用25000×g离心10分钟)
弃掉乙醇,室温干燥沉淀3分钟(注意不要过渡干燥沉淀,否则难以溶解),视沉淀多少将其溶于适量DEPC水中,分装一部分用于质量检测,其余冻存于-70℃冰箱中备用。
F RNA质量检测
1. 取1μl样品,1%琼脂糖凝胶电泳检查RNA完整性。如果28S和18SrRNA条带清晰整齐,且28S条带的亮度是18S的两倍,说明RNA完整性较好。
2. 浓度测定:取1μl样品,稀释至50ul,测定OD260和OD280及其比值。若OD260/ OD280>1.8,说明RNA纯度较好。
对于RNA样品:OD260的值为1时,RNA的浓度为40μg/ml,
即:1 OD260=40μg/ml RNA, 所以如果稀释倍数为200,则:
RNA样品浓度= OD260 × 40μg/ml × 稀释倍数
= OD260 × 40μg/1000μl × 200
=OD260×8(μg/μl)
G 提取RNA注意事项
①Trizol用量为材料的10倍体积,材料过多易造成降解。研磨材料时要保持低温,以防RNA降解。
②RNA干燥时间过长则不易溶解,注意当沉淀边缘变模糊时即可停止干燥,开始溶解。
③实验中所用有机废液应倾倒至指定容器中,以免腐蚀下水管道。
④Trizol有一定毒性,避免接触皮肤和眼睛。
附RNA电泳图谱: